2015-09-14 听力学与耳鼻咽喉头颈外科

标题：92例国人Alport综合征的临床听力学特点分析

作者：陈丽 薛俊芳 张琰琴 王芳 陈斯琦 段继波 刘玉和 丁洁

中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2014年11月第49卷第11期第902-907页 

文章标题：92例国人Alport综合征的临床听力学特点分析

本文作者：陈丽1 薛俊芳1 张琰琴2 王芳2 陈斯琦1 段继波1 刘玉和1 丁洁2

1 北京大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科 100034

2 北京大学第一医院儿科

通信作者：刘玉和

E-mail: liuyuhefeng@163.com

基金项目：国家自然科学基金面上项目（30872864，81271083）

【摘要】

目的：分析中国人Alport综合征患者的临床听力学特点，并探讨Alport综合征的基因型与听力表型的关系。

方法：总结2008年8月至2013年8月期间确诊为Alport综合征的92例患者的临床资料，对主要临床听力学表现进行回顾性分析。采用检测皮肤成纤维细胞mRNA的方法或外周血DNA扩增直接测序的方法对其中17例患者进行IV型胶原α3或α5链基因的检测。

结果：92例患者中X连锁显性遗传87例，常染色体隐性遗传5例。44例患者听力正常，其中14例未成年患者耳声发射（OAE）异常，包括幅值降低、部分引出和未引出；48例（52.2%）患者纯音听阈异常，，其中男35例、女13例，均为感音神经性聋；听力曲线：槽型21例、下降型13例、平坦型10例、高频陡降型3例以及上升型1例。X连锁显性遗传Alport综合征患者中听力下降者共43例（49.4%），其中男性听力下降发生率55.0％（33/60例），女性37.0％（10/27例），均表现为轻、中度听力下降，没有重度和极重度者。17例行基因检测患者共检出16种突变，其中听力下降为中度及以上的8例患者均为严重突变。

结论：中国人Alport综合征的听力下降以轻、中度为主，听力曲线以槽型为主。OAE在听力损害早期诊断中有重要意义。听力下降表型与基因型可能具有一定的相关性。

【关键词】肾炎，遗传性；听觉丧失；突变

Alport综合征（Alport syndrome,AS）是一种以血尿、肾功能进行性减退为主要表现，常伴有感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性基底膜病变性疾病[1]。已有研究表明，AS是经典的单基因遗传病，遗传方式包括：X连锁显性遗传（约占80%）、常染色体隐性遗传（约占15%）和常染色体显性遗传（极少数）[2]。AS并不罕见，其发病率在1/5000-1/50000[3]。听力损害是AS常见的症状之一，但不同人群听力损害的发生率不同，不同遗传方式听力损害的发生率也不同[4]。我们总结了92例中国AS患者的临床听力学特点，并结合基因突变分析报告如下。

资料与方法

1.一般资料

收集北京大学第一医院2008年8月至2013年8月诊治的临床资料完整的AS患者92例，其中男性62例，女30例；年龄1-54岁，中位年龄13岁。所有患者均无终末期肾病。

AS诊断标准参照参考文献[5]：①肾炎，家族史或先证者的一级亲属或女方的男性亲属中有不明原因的血尿者；②持续性血尿，无其他遗传性肾脏病的证据，如薄基膜肾病，多囊肾或IgA肾病；③双侧2～8kHz范围的感音神经性耳聋，耳聋为进行性，婴儿早期正常，大多于30岁前发病；④COL4An（n=3，4或5）基因突变；⑤免疫荧光学病理学检查显示肾小球和（或）皮肤基底膜完全或部分不表达Alport抗原簇；⑥肾小球基膜超微结构显示广泛异常，尤其是增厚、变薄和断裂；⑦眼部病变，包括前圆锥型晶状体、后囊下白内障、后多型性萎缩和视网膜斑点；⑧先证者或至少两名家庭成员逐渐进展至终末期肾脏病；⑨巨血小板减少症或白细胞包涵体；⑩食管和（或）女性生殖道的弥漫性平滑肌瘤。如果直系家庭成员符合上述标准中的四条，即可诊断AS家系；诊断AS家系中家庭成员是否受累，若该个体符合相应遗传型，并符合上述标准2～10中的一条，可做拟诊，符合两条便可确诊。对于无家族史个体的诊断，至少应符合上述指标中的四条。本研究的病例均由肾脏病专业的专家做出临床诊断，并分析遗传方式。遗传方式的判定依据：除根据家族史或家族中已有患者证实遗传方式外，还可根据皮肤基底膜IV型胶原蛋白α5链[α5(IV)链]和（或）肾小球基膜α3-α5(IV)链染色判断，染色阴性或间断阳性均为异常，可以诊断为X连锁遗传型AS；皮肤基底膜α5(IV)链染色正常，肾小球基膜α3-α5(IV)链染色阴性，肾小囊基膜α5(IV)链阳性，可以诊断为常染色体隐性遗传型AS。经COL4A3-6基因突变分析，亦可确诊X连锁或常染色体遗传方式。本研究中共17例AS患者进行了基因诊断，该研究获得了医院伦理委员会批准，所有参与基因突变检测的患者或家属均签署知情同意书。

2.耳科检查

所有患者均进行常规耳鼻咽喉科检查，除外外、中耳病变。所有听力学检查均在隔声或隔声电屏蔽室内进行。应用美国GSI公司的GSI-16型听力计行纯音测听检查；应用丹麦Madsen公司的ZO901中耳分析仪行声导抗检查。丹麦尔听美公司CAPELLA耳声发射仪行耳声发射（OAE）检查：①TEOAE，刺激声为非线性短声，刺激强度80dBSPL，通过标准为相关性﹥60%，信噪比﹥6dB；②DPOAE，刺激声为f1/f2=1.2，两个纯音强度分别为L1=65dB SPL，L2=55dB SPL，通过标准为信噪比﹥6dB。丹麦尔听美公司CHARTREP脑干诱发电位仪行听觉脑干反应（ABR）检查，刺激声为短声，插入式耳机给声，叠加1024次，速率11.1次/s。5岁以下儿童不能配合纯音测听者，均行ABR和40Hz相关电位检查评估听阈。5岁以上及成人者未行此两项检测。

耳聋程度按照纯音测听500、1000、2000和4000HZ的平均听阈（PTA）进行分类，轻度：26-40dBHL；中度：41-70dBHL；重度：71-90dBHL；极重度：91dBHL以上。7例5岁以下儿童以ABR和40Hz相关电位反应阈的平均值参考以上标准进行评估。两耳在至少2个频率听力相差15dB以上或4个频率相差10dB以上定义为非对称性听力减退，如两耳相同频率听力相差<15dB>

3．基因突变检测

检测方法见参考文献[7]，AS患者行皮肤穿刺术，取直径5 mm、深约1 mm的皮肤组织标本培养后提取成纤维细胞总RNA，同时提取患者外周血DNA保存备用。设计5对引物覆盖IV型胶原蛋白α5链基因（COL4A5）全部编码区cDNA，应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增5个片段，直接Sanger测序（由北京华大基因研究中心完成）。如发现变异，则设计COL4A5基因引物，PCR扩增外周血基因组DNA相应外显子验证。或者取外周血，常规提取DNA，设计覆盖COL4A3或COL4A5基因全部外显子的引物，PCR扩增后直接Sanger测序［8］。其中大片断缺失、重排、无义和移码突变等导致Ⅳ型胶原蛋白结构或功能明显异常者是COL4A3或COL4A5基因严重突变[9,10]。

结果

1.听力学检测结果

92例AS患者中X连锁显性遗传87例，占94.6%；其中男60例，女27例，男性明显多于女性。87例X连锁显性遗传患者根据年龄分为学龄前儿童组（<6>

92例AS患者声导抗检查均正常；OAE检查66例异常（包括幅值降低、部分引出和未引出），48例纯音听阈下降者OAE均异常，44例纯音听阈或ABR+40Hz 相关电位阈值正常患者中18例OAE异常（其中儿童及青少年14例，成人4例）。DPOAE异常早期可表现为中频幅值降低。

X连锁显性遗传出现听力下降的43例AS患者中，男性33例（占76.7%），女性10例（占23.3%）；男性听力下降发生率为55.0%（33/60），女性为37.0%（10/27）。听力下降程度与性别的关系中，男性患者轻度听力下降15例，中度18例，没有重度、极重度听力损害；10例女性患者均为轻度听力下降。图2显示了X连锁显性遗传AS患者性别和年龄对听力下降程度的影响，表1为不同年龄组中X连锁显性遗传患者的听力下降程度。从学龄前至成人各年龄段均有患者出现听力下降，男性学龄组听力下降发病比例最高（66.7%），其次是青少年组（55.0%），学龄前组最低；而女性患者均在成年后才出现听力下降，男性发病年龄明显较早于女性。

2.基因检测结果

17例AS患者行基因突变检测，共检出16种COL4A5或COL4A3基因突变，分别可引起单个氨基酸改变、氨基酸序列改变、蛋白截短、蛋白无表达，导致蛋白结构或功能不同程度的改变。8例（6例男性X连锁显性遗传患者，2例常染色体隐性遗传患者）中度及以上听力下降患者中6例检出严重突变（表2）。

讨论

AS患者的遗传方式有三种：X连锁显性遗传、常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传，其中以X连锁显性遗传最多见，常染色体隐性遗传次之，常染色体显性遗传少见。本组研究中X连锁显性遗传患者占94.6%，可见X连锁显性遗传在中国也是最常见的。虽然X连锁遗传为显性遗传，但性别对发病影响很大，本研究中男性患者明显多于女性，与文献报道相似[2]。本组病例中X连锁显性遗传和常染色体隐性遗传均可引起听力损害，虽然5例常染色体隐性遗传AS患者均有较重的听力损害，但由于例数少，无法比较不同遗传方式与听力损害发生情况是否相关。本组病例符合文献报道的AS听力学特点，即双侧对称性感音神经性聋。以往报道AS患者中感音神经性聋的发生率为50%-67%不等[17]，而且男性发病率明显高于女性[4]。本组病例中听力下降的发生率为52.2％，其中X连锁显性遗传男性的听力下降发生率为55.0%，明显高于女性，与国外的报道相似。

AS患者临床症状中血尿通常在早期出现，而感音神经性聋通常出现在学龄期，青春期末时可发展至终末期肾病。本组病例中，听力下降主要出现在学龄期和青少年期，成人期的发病率反而下降，尤其是男性。这可能与成人期后进入终末期肾病，没有纳入本组研究有关。从发病年龄看，学龄前至成人期的各年龄阶段均可出现听力损害，但未发现听力损失严重程度与年龄呈相关性。本组听力下降的最小年龄为5岁，但有1例X连锁显性遗传患儿3岁时已表现出OAE的异常，提示内耳损害的发生时间可能更早。听力下降可以是AS的首发症状之一，各年龄阶段均可发病，但往往到青春期后才有较明显的主观症状。大多数在青少年期出现听力下降，听力改变往往出现于肾功能异常前，故听力下降进展提示肾脏预后不良[18]。因此，听力状况有可能作为判定肾脏预后的一项指标，监测AS患者听力变化是必要的。

文献报道AS通常为双侧对称性感音神经性聋，儿童及青少年期呈现进行性加重的特点，中年后听力下降基本稳定，即使听力损失较严重的患者也有残余听力；听力曲线形式多样，以高频听力损害为主，呈下降型曲线，还可有上升型（低频下降）和槽型听力曲线[6]。我们发现听力曲线以槽型为主，特别是早期，DPOAE可表现出槽型特点。病变早期听力轻度下降，且开始多累及高频区，尚未累及日常谈话频率区，加之患者发病年龄较小，故主观难以察觉，需作听力检查才能发现。本组中X连锁显性遗传男性患者12岁时听力下降发病率为66.7%，比文献报道低，而且是以轻、中度为主，也没有国外报道的语言频率平均听阈66dB的严重[19]。本组X连锁显性遗传女性患者的听力下降发生率虽与国外报道相似，即在中年时只有约半数患者出现听力下降，但是国人女性的听力下降程度明显低于国外报道的语言频率平均听阈50dB[19]。提示AS在不同种族间听力下降程度存在差异。本组中有14例听阈正常的未成年患者OAE异常，OAE是一种观察耳蜗病变非常灵敏的方法，在反映耳蜗功能上较纯音测听敏感，因此OAE可用作于AS患者听力损害的早期监测。

AS是否伴随听力损失以及发生听力下降的年龄可能与IV型胶原α链的编码基因的突变类型有关。至今已有300多个COL4A5基因的突变位点被发现，并继续不断被报道，其突变形式多样，包括点突变、缺失及插入突变等，可导致错义突变、拼接突变、移码突变或截短突变[20]。由于IV型胶原α3、α5 链是参与调控耳蜗螺旋韧带、螺旋嵴、基底膜网状结构活性的关键蛋白，当其基因发生突变时耳蜗功能会受到不同程度的影响，从而在临床上表现为感音神经性聋。有国外学者提出COL4A5基因突变的类型可能会影响临床上听力损失等症状的出现，该研究分析了来自175个家系的681名男性X连锁显性遗传患者，发现错义突变比移码突变、截短突变以及缺失突变更少发生听力下降，突变发生部位靠近基因5’端的患者更易出现眼部及耳部症状[17]。其他研究也证实了错义突变AS患者发生听力下降的可能性较其他突变更低[9]。女性患者也有类似的结论，不过发生率较男性低[21]。因此，缺失、重排、无义和移码突变等导致Ⅳ型胶原蛋白结构或功能明显异常的突变也称作AS的严重突变[9,10]。本组病例中基因检测例数虽少，但亦有相似的结论，即AS听力学表型与基因型密切相关，而且与发病年龄似有相关性。实际上，AS患者终末期肾病的发生也与突变类型有关，COL4A5基因错义突变的患者终末期肾病发病年龄平均在37岁，拼接点突变发病年龄平均在28岁，而蛋白截短突变的发病年龄平均在25岁[17]。另外发病年龄也与突变点位置有关，越靠近基因5’端的突变发病年龄越小。关于中国AS患者的听力表型与基因型的关系，还有待大宗病例的研究。

综上所述，AS患者听觉损害表现为感音神经性聋，呈现双侧对称性，听力下降曲线以槽型为主；OAE检查较纯音测听敏感，可早期发现耳蜗功能的损害。AS患者的听力表型与基因型之间可能存在一定的相关性。

参考文献.

1. Kashtan CE, Michael AF. Alportsyndrome[J]. Kidney Int, 1996,50(5):1445-1463.

2. Pirson Y. Making the diagnosis of Alport’s syndrome[J]. Kidney Int,1999,56(2):760-775.

3. Levy M, Feingold J. Estimating prevalence in single-gene kidney diseases progressing torenal failure[J]. Kidney Int. 2000,58(3):925–943.

4. Alves FR, de A Quintanilha Ribeiro F. Revision about hearingloss in the Alport’s syndrome, analyzing the clinical genetic and bio-molecularaspects[J]. Bras J Otorrinolaryngol,2005,71(6):813-819.

5. 丁洁. Alport综合征的诊断[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2010,19(4):344-345.

6. Alves FR, Ribeiro Fde A. Clinicaldata and hearing of individuals with Alport syndrome[J].Braz J Otorhinolaryngol. 2008 ,74(6):807-814.

7. 王芳, 丁洁, 俞礼霞, 等. 检测皮肤成纤维细胞cDNA确定Alport综合征COL4A5基因突变[J]. 北京大学学报(医学版). 2002,34(3): 219-224.

8. Zhang Y, Wang F, DingJ, et al. Genotype-phenotype correlations in 17 Chinese patients with autosomalrecessive Alport syndrome[J]. Am J Med Genet A. 2012,158A(9):2188-2193.

9. Jais JP, Knebelmann B, Giatras I, et al.X-linked AlportSyndrome: natural history in 195 families and genotype-phenotype correlationsin males[J]. J Am Soc Nephrol. 2000,11(4):649-657.

10. GrossO, NetzerKO, LambrechtR, et al.Meta-analysis of genotype–phenotype correlationin X-linked Alport syndrome: impact on clinical counselling[J].NephrolDial Transplant. 2002,17(7):1218–1227.

11. Wang F, Zhao D, Ding J, et al. Skin biopsy is apractical approach for the clinical diagnosis and molecular genetic analysis ofX-linked Alport's syndrome[J]. J Mol Diagn. 2012 ,14(6):586-593.

12. KnebelmannB, Breillat C, Forestier L, et al. Spectrum of mutations in the COL4A5 collagengene in X-linked Alport syndrome[J]. Am J Hum Genet. 1996,59(6):1221-1232.

13. Pont-KingdonG, Sumner K, Gedge F, et al. Molecular testing for adult type Alport syndrome[J]. BMC Nephrol. 2009 , 10:38.

14. NakazatoH, Hattori S, Ushijima T, et al. Splicing mutations in the COL4A5 gene inAlport's syndrome: different mRNA expression between leukocytes and fibroblasts[J]. Am J Kidney Dis. 1995,26(5):732-739.

15. 张琰琴, 赵丹, 俞礼霞, 等. 多重连接依赖性探针扩增技术在X连锁Alport综合征基因诊断中的应用[J]. 中华医学杂志. 2012;92(40):2825-2829.

16.Wang F, Wang Y, Ding J, et al. Detection of mutations in the COL4A5 gene byanalyzing cDNA of skin fibroblasts[J]. Kidney Int. 2005 ,67(4):1268-1274.

17. BekheirniaMR, Reed B, Gregory MC. et,al. Genotype-Phenotype Correlation in X-LinkedAlport Syndrome[J]. J Am Soc Nephrol. 2010;21(5):876–883.

18.Gluber M, Levy M, Broyer M, et al. Alport’s syndrome.A report of 58 cases and areview of the literature[J]. Am J Med. 1981;70（3）:493-505.

19. FlinterF. Alport’s syndrome[J]. J Med Genet. 1997;34（4）: 326-330.

20. KruegelJ, Rubel D, Gross O. Alport syndrome--insights from basic and clinical research[J]. Nat Rev Nephrol. 2013 ，9(3):170-178.

21. JaisJP, Knebelmann B, Giatras I, et al. X-linked Alport syndrome: natural historyand genotype-phenotype correlations in girls and women belonging to 195families: a "European Community Alport Syndrome Concerted Action"study[J]. J Am Soc Nephrol. 2003，14(10):2603-2610.

（手稿日期：2014-05-01 本文编辑：金昕）